لطلاب وطالبات البكالوريوس في microbiology لعلم الفيروسات سلسلة من الأبحاث العلمية لدرجة الماجستيرمن كلية العلوم الطبية جامعة الملك سعود وجامعة نيويورك

تنقية الفيروسات

(purification of viruses)

تعني تنقية الفيروسات عمل حصاد لها (HARVEST) لمصر كبير من الفيروس المتكاثر بغية الحصول علية في صورة نقية جداً أي مفصولاً ومنزوعاً ومنفرداً بعيداً عن محتويات الخلايا التي تتكاثر فيها ومكوناتها . وسبب حصول الفيروس بصورته النقية من اجل عمل التحليلات الكيميائية والدراسات الوراثية والدراسات المصلية الخاصة بالفايروس وتحضير أنواع من اللقاحات أو الطعوم (VACCINES).
1- عمل حصاد للفيروس (preparation of virus harvest)
بالنسبة للفيروس المعزول isolated virus متطلب لتنقيته وإكثاره على نطاق كبير في العائل المناسب وعادة ماتتكاثر :
-الفيروسات النباتيه بعد حقنها في نباتات صغيره مزروعه في بيةت محميه منيعه من الحشرات
-الفيروسات الحشرات بعد حقنها بيريقات الحشرات أثناء مراحل نموها (larvae)
-الفيروسات الحيوان والإنسان بعد حقنها إما بالحيوانات التجريبيه (experimental animals) أوداخل أجنة الدجاج داخل البيض (chick embryos) أو في مزارع الأعضاء والخلايا (orgen of tissue cultwre).
أما الفيروسات اللتي تصيب البكتيريا والأكتينومايسيتات تتكاثر بكفاءه عالية في مزارع حديثه (young eultures) من 3-8 ساعات في الأوساط الغذائية السائلة.
ولابد من حصاد كمية ضخمة من المادة الصلبة والشروع فيه ويتم التخزين مابين 70-196 درجة مئويه لحين الحاجة إليه ووضعه في محلول منظم (buffer) ضماناً لثبات الأس الهيدروجيني .
ويمكن عمل مهروس (homogenyenate) مباشرة من الخلاياالمصابة أو من العينات المجمدة بالتبريد.ويعمل هذا المهروس بالطحن في الخلاط أو موجات فوق صوتية أو التجميد (freezing ultrasonic) والصهر ( thawing) لعدة مرات .
وإضافة منظف (detergent) مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم (S D S) أو دي أوكسي كولات يمكن أن تساعد في تحرير (release) الفيروسات من الخلايا العائلة كما أن من المهم إضافة مثبطات للإنزيمات (enzyme inhibi tars) حتى تعوق تأثير أية إنزيمات قد تهاجم البروتين الفيروسي أو الدهون أو الجليوكوبروتين مما يتسبب عن تحلل الدقائق الفيروسية وتفككها.
الطرد المركزي التفاضلي
DIFFERENTENTIAL CENTRIFUGATION

اول خطوة في تنقية الفيروس عادة هي إجراء الطرد المركزي على مهروس الخلايا المصابة وذلك من أجل كسر الخلايا الغير مكسورة وكسر الخلايا (brken cells) والكتل البروتوبلازمية والأنوية وأي عضيات آخرى
ويجب أن تجرى كل عمليات تنقية الفيروسات تحت ظروف من التبريد (cooling) لأن الحرارة تفكك العديد من الفيروسات وتفقدها حيويتها وقدرتها على إحداث الإصابة كما أن الطرد المركزي يولد حرارة تدمر الفيروسات وتراكيبها.
ويجرى الطرد المركزي عادة في دورتين أو ثلاث مابين الطرد المركزي عالى السرعه أو منخفض السرعه high speed centrifugation or low speed centrifugation
-يعبأ مهروس الخلايا في أنابيب طرد مركزي تملاء إلى 2/3 حجمها ثم توزن الأنبوبتين بالتساوي وتوضع متوازيتين أمام بعضها في تجاويف الرأس اللفافه head=rotor سواء كانت ثابته (fixed angle) أو متمرجحه (swinging ).
-وتجرى عملية الطرد المركزي عند سرعة 2000-5000 لفة في الدقيقة (R.P.M) وذلك لمدة 30 دقيقة حتى يتم ترسيب كل بقايا الخلايا في صورة راسب pellet على إحتواء الرائق supertnatant يحتوى على الفيروس وبقايا الخلايا الصغيرة وعضياتها
-بعد ذلك يؤخذ الرائق المحتوى على الفيروس ويعاد توزيعه في أنابيب طرد مركزي ويعرض لطرد مركزي عالي عند 10000-30000 لفه في الدقيقه لمدة نصف ساعة عند درجة حرارة 4 درجه مئويه .
في النهاية تترسب من المعلق كل المحتويات مثل الفيروس والبقايا الخلوية الصغيرة جداً وعضيات الخلية ويؤخذ هذا الراسب بعد فصله عن الرائق سريعاً ويذوب في بضعة مليلمترات من المحلول المنظم ثم يعرض مرة أخرى لطرد مركزي منخفض السرعه ثم عالي السرعه
ويستخدم الراسب الذي تكون في دورة ثالثة من الطرد المركزي وذلك للحصول على تحضيرشبه نقي parfially purified أو منقى كما في حالة فيروس تبرقش التبغ (TMV) ويحتاج هذا التحضير مزيداً من عمليات التنقية.






ومن الطرق المستخدمة لعمليات تنقية الفايروسات :

(1) الترسيب بالطرد المركزي على متدرج كثافة السكروز.

(2) الطرد المركزي المتوازن (isopycnic centrfagation).


(3) الترشيح خلال الهلام gelfiltration والفصل اللوني الطبقي بالتبادل الأيوني ionexchange chromatog raphy.



(4) طرق الترسيب (precipitation procedures) عن طريق الآتي:
أ‌- التمليح
ب‌- إضافة بولي إثلين جليكول 6000 الصلب وكلوريد الصوديوم الصلب (7جم/لتر)
ج- إضافة خلات الزنك zinic acetate إلى مهروس الفيروس عند أس هيدروجيني متعادل .




طريقة الإدمصاص الدموي

Haemadsorption



سهلة وسريعه ومنتجه في تنقية أنواع معينة من فيروسات الإنسان والحيوان
وخاصة تلك اللتي تملك الإدمصاص الدموي (أي الإلتصاق بكرات الدم الحمراء ) مثل فيروس الأنفلونزا (influenza) والحصبة (measles) فعند خلط متجانس من الفيروس غير النقي مع كرات الدم الحمراء تتشابك الفيروسات مع كرات الدم الحمراء عند درجة حرارة 4درجات مئوية وتحضن بضع ساعات ثم يفصل راسب الفيروس وكرات الدم عن باقي الشوائب بالطرد المركزي ويؤخذ الراسب ويوضع في محلول منظم ـــــــــــــــــ عند درجة حرارة (37م) لساعات يفصل الفيروس نقياً بعد الطرد المركزي ويؤخذ الراسب ويوضع في محلول ـــــــــــــــــ منخفض السرعه ـــــــــــــــ3000 لفه في الدقيقة لمدة 15 دقيقة وذلك لأن الإنزيم المحطم لمواضع الإستقبال (RED) يعمل على الخلايا فيفصل الفيروس بعيداً عن خلايا الدم الحمراء.

ومن الطرق المستخدمة في تنقية الفايروسات .

-الأدلة على نقاوة تحضير الفيروس CRITERIA FOR VIRUS PURIFICATION:


1- بواسطة قياس الضوء الطبقي (spectrophotometry) وذلك بقياس التحضير المنقى النهائي على جهاز مقياس الضوء الطيفي مزود بمصباح أشعة فوق البنفسجية (uv lamp).



2- بواسطة النظائر المشعة (radioisotopes).
3- بإختبارات الإصابة (byinfectivity tests).
4- بالأختبارات المصلية (serological tests).
5- بالمجهر الألكتروني (electron microscopy).



مثال لطريقة لتنقية الفيروس :


تنقية فيروس تبرقش الأصغر في اللفت (TYMV) (TURNIP) تبعاً لطريقة markham ,smith عام 1949م وتتلخص مايلي :



1- إحداث أصابة infeetion للكرنب الصيني Chinese cabbage أو اللفت للفيروس .

2- جمع المحصول harvest أوراق النباتات بعد شهرين من الإصابة ثم طحنها في محلول منظم .


3- روًق clarify العصير وذلك بإضافة 300 مل من إيثانول 90% لكل لتر من العصير ثم صفها في أنابيب ودورها في centrifuge عند 3000-5000 لفه في الدقيقة حتى يترسب البروتين النباتي المتكتل ثم أجمع السائل المفصول اللذي يكون لونه أصفراً معتماً (supernatant floceulated) .

4- إضافة للسائل يضاف نصف حجمه من محلول مائي لكبريتات الأمونيوم المشعه ثم يبدأ الفيروس بالتبلور نحو 4-5 ساعات .


5- ثم القيام بعمل طرداً مركزياً عندى 2000 لفه في الدقيقة لترسيب البلورات وأذب البلورات في الماء ثم أعد الطرد المركزي .


6- أعد البلورة RECYSTALLIZATION للفيروس من كبريتات الأمونيوم 3 إلى 4 مرات لتحصل على بلورات ثمانية الأضلاع من الفيروس النقي .

===============================================================

الأسئلة والتمارين للمقر علم الخلية للفصلين الأول والثاني :

(1) أعط عدداً من الطرق المستخدمة لتنقية فيروسات للنبات والانسان والحيوان؟

(2) مالسبب المتطلب للحصول على الفيروس بصورته النقية ؟

(3) كيف يتم التكاثر للفيروس في الأوساط التالية:
1- الفيروسات النباتية ؟
2- الفيروسات الحشرات؟
3- الفيروسات الحيوانية؟

(4) لماذا يضاف منظفات ومثبطات للإنزيمات أثناء عمل الحصاء للفيروسات,وعدد أثنين لتلك المنظفات اللتي تستخدم أثناء عمل الحصاد الفيروسي؟

(5) عدد ثلاثاُ من الأدلة الخاصة على نقاوة الفيروسات ؟

(6) من الطرق المستخدمة لتنقية الفيروسات طريقة الترسيب عدد الطرق المستخدمة أثناء الترتيب لعمل التنقية بالترسيب,ومالنسب المستخدمه فيها؟

لطلاب وطالبات البكالوريوس في microbiology لعلم الفيروسات سلسلة من الأبحاث العلمية لدرجة الماجستيرمن كلية العلوم الطبية جامعة الملك سعود وجامعة نيويورك

تـــــاريــــــــــــــخ الفـــــيروســــات

HISTORY OF VIRUSES

1- ثبت أن أول السجلات الطبية عن الأمراض الفيروسية موجودة على جدران أحد المعابد المصرية القديمة قبل 3000 سنه قبل الميلاد وبين وجود كاهن مصاب بشلل الأطفال وذلك بقصر قدميه وانحنائها وعرف أنه أصيب بمرض شلل الأطفال(poliomyditis).
2- أول وصف علمي للفيروسات يرجع تاريخه 1576م عندما قام العالم carolus clusias عن تبرقش أزهار التوليب لغلافها الزهري وسببه فيروس ينتقل بواسطة المن( (aphid.

3- عام 1865م أظهر Louis pastear ويشاركه الألماني Robert Koch عام 1876م في تأسيس النظرية الميكروبية (germ theory)حينها أكتشف Louis طعم أو لقاح (vaccine) ضد السعار (داء الكلب) (rabies) وذلك باستخدام أمخاخ الكلاب المسعورة (rabid dogs) وتمرير مستخلصاتها عدة مرات على مخ الأرانب فيؤدي إلى أحقان الفيروس ويعطي مناعة عند حقنه في الناس الذين عضهم كلب مسعور.

4- جاء dimetry evanowski عام 1892م وقدم ول دليل على وجود الفيروس وذلك بأبحاثه على مرض تبرقش التبغ.
5- جاء أول أثبات أن الفيروسات تسبب السرطان عندما قام pyton rouse الحاصل على جائزة نوبل بإثبات وجود سرطان في الدجاج fowl وأمكن نقل هذا السرطان عن طريق حق الراشح العالي لأنسجة مصابة في دجاج سليم فأظهر سرطانات وسمي (rous sarcoma viruses) وبعدها فتح مجال البحث للعلماء عن فيروسات تسبب سرطانات في الإنسان والحيوان والنبات.
6- تمكنschlesinger من عزل وتنقية بيكتروفاج سمي wll يصيب البكتيريا العصوية القولونية (eschirichia coli) ووجد بإحتوائة على البروتين وحامض الفسفوريك كما أقترح وجود الحامض النووي (nucleic acid)ووصفها
أ-دقائق (PARTICULATED*). ب-جزيئات بسيطة كيموحيويه.
7- تم تخليق فيروسي TMVوفاج Q X -174 بالعام (1967م-1972م) بواسطة العالمKORNBERG.

8- في العام 1976م استخدمت الفيروسات أدوات أساسية في الهندسة الوراثية (GENETING ENGINEERING)* وتقنية معاودة ارتباط ح ن د D N A (RECOMBINANT TECHNOLOGAY).
طبيعة الفيروسات
THE NATURE OF VIRUSES


الفيروسات مجموعه من الأحياء الدقيقة صغيرة الحجم والشكل والتركيب وتختلف اختلافا كلياً عن الكائنات الحية الأخرى بما فيها باقي الأحياء الدقيقة ولها مملكه مستقلة بذاتها أسمها مملكة الفيروسات ( KIGDOOM VIRATAE) .

الصفات العامة للفيروسات (GENERAL PROPERTIES OF VIRUSES).

(1) أنها صغيرة الحجم (MINWTEIN SIZE) يتراوح مابين 10-350 نانومتر
(2) أنها قابله للترشيح (ultrafiltrable)
(3) بسبب صغر حجمها فهي تفوق قدرة المجهر الضوئي (ultramicroscopil) .
(4) أنها متطفلة إجبارية داخل الخلية للعائل (oblingate intracellular parasithe)
(5) المكونان الأساسيان للفيروس هو:
a- الحامض النووي DNAوالمعروف بالمورث (GENOME).
b- البروتين وهو يكون الغطاء أو العلبة.
(6) الفيروس بسيط في تركيبه خامل أيضاً (metabolically) بعدم امتلاكه أصولاً أو مواد خام ولا مصادر طاقة ولاأنزيمات أكسدة ولاإختزال وهي ثابتة الشكل الهندسي.
(7) يمكن زراعتها وإكثارها في الخلايا الحية لغوائلها لكن لايمكن أن تحتوي على أوساط بكترولوجية.
(8) تتكاثر الفيروسات داخل العائل اللذي تصيبه لتنتج وحدات تكاثر تكرارية هي الفيروسات (replica) .
فنكتفي بما في الصفات العامة للفيروسات أن نعطي تعريفاً لها وهو تعريف (lwoffr1959) وهو:
الفيروسات وحدات entities داخل الخلية (intracellular) ذات قدرة ممرضة (pothogenic)وطور معد(infectious phase) وهي:
1- تحتوى على نوع واحد من الأحماض النووية.
2- تتكاثر في صورة مادتها الوراثية.
3- غير قادرة على النمو(grouth) أو الانقسام الانشطاري(binary fission).
*من المصطلحات الخاصة بالفيروسات :
1- الغطاء (capsid) وهو الغطاء أو العلبة (shell) من البروتين وهو يحيط بالمورث الحامض النووي للفيروس.
2- (NUCLEOCOPISID) . ويشمل الغطائيين معاً لغطاء والحامض النووي الفيروسي.

3- (NUCLEOPROTEIN) :(بروتين نووي)وهو يضم الحامض النووي الفيروسي مع بعض بروتينات الفيروس.
4- (STRUCTURAL UNITS): وهي وحدات أساسية ويبنى منها الغطاء .
5- الفيرون (VIRION): وحدات دقيقة فيروسية قادرة على أصابه العائل وقد يكون مكونان من الغطاء والحامض النووي:
1- يسمى الفيروس عارياً وذلك بوجود طبقة البروتين والحامض النووي مثل مرض شلل الأطفال (poliovirus) .

2- ويسمى الفيروس المعقد عندما يكون محاطاً بغشاء مزدوج من البروتين الدهنى فيسمى فيروساً مغلقاًُ (enveloped viruses) مثل فيروس الأنفلونزا(influenza).
-------------------------------------------------------------------------
3- الفيروس الناقص (defective virus) :
دقيق فيروسي به عيب وظيفي في إحدى مراحل تكاثره وذلك بنقص المادة الوراثية أو أكثر لعطب فيه وكثيراً مايتداخل الفيروس الناقص Dفي تكاثر الفيروس القياسي (s=standard).
4- الفيروس الكاذب :
دقيقة فيروس مشابهة للفيروس داخل الخلية المصابة للفيروس في تكاثره وقد يكون غطاء الفيروس الكاذب يحتوى على مادة وراثية بالخلية أو عضيات الخلية بديلاً عن المادة الوراثية.
فيروسات عديدة الدقائق (multiparticle viruses):
تتكون من 2-5 دقائق وفيها تتكون المادة الوراثية من جزيئات دقيقة كل جزئ يسكن داخل غرف مستقلة وهي قادرة على إصابة العائل مثل-إصابة الفيروسات النباتية ,مثل فيروس تبرقش الخيار (cucumber mosais virus) وفيروس تبرقش البرسيم الحجازي(alfalfa mosaic)
واللذي يتكون من 5 دقائق للفيروس الواحد.
5- الفيروسات المذنبة (satellite viruses):
تتكاثر بوجود فيروسات أخرى معها من عائلة أخرى وهو يقوم بدور المساعدة في تكاثر الفيروس الأول مثل – مذنب فيروس تبرقش التبغ(tobacconeerosis satellite viruses =STNV).

==================================================================
الأسئلة والتمارين المتعلقة بالفصل الأول لعلم الفايروس:

(1)- أستخدم العالم (Louis Pasteur) الكيميائي طعم أو لقاح من نفس المرض اللذي يصيب الأشخاص ليعمل مضاد أومصل له ,أوضح كيف تبين أكتشاف المرض من خلال إصابتة للشخص وماطرق العلاج المستخدمة لعمل مضاداًله ليعطي مناعة له؟

(2)- بين من خلال ماتعلمته عن الفيروس وكيفية معيشته بإعطاء صفاته اللتي يتعايش بها داخل الكائن الحي وبعض مكونات التي يجعلة متعايشاً داخل التكوين الخلوي؟

(3)- عندما يصبح الغطاء عارياً (naked) أو غير مغلفاً للفيرون هل يصبح قادراً على إصابة وإحداث مرضاً للعائل,ومالسبب في تسميته فيروناً عارياً, ومثًل علية بمرض يصيب الإنسان ؟

(4)- وضح كيف يعمل الفيروس الكاذب داخل الخلية ,ومدى مشابهته هندسياً للفيروس الصحيح؟